Cloning and expression of synthetic genes encoding the broad antimicrobial spectrum bacteriocins SRCAM 602, OR-7, E-760, and L-1077, by recombinant Pichia pastoris

Abstract

Hemos evaluado la clonación y expresión funcional de las bacteriocinas de amplio espectro antimicrobiano ya descritas SRCAM 602, OR-7, E-760 y L-1077, por Pichia pastoris recombinante. Los genes sintéticos, que coinciden con el "codon usage" de P. pastoris, se diseñaron a partir de la secuencia de aminoácidos madura conocida de estas bacteriocinas y se clonaron en el vector de expresión de proteínas pPICZαA. Los plásmidos derivados recombinantes se linealizaron y se transformaron en P. pastoris X-33 competente, y se confirmó la presencia de plásmidos integrados en las células transformadas mediante PCR y secuenciación de los insertos. La actividad antimicrobiana, esperada en los sobrenadantes de los productores recombinantes de P. pastoris, se purificó usando un procedimiento cromatográfico multietapa que incluye precipitación con sulfato de amonio, desalinización mediante filtración en gel, intercambio catiónico, interacción hidrófoba y cromatografía de fase inversa (RP-FPLC) . Sin embargo, solo se detectó una actividad antimicrobiana medible después de la interacción hidrofóbica y las etapas de RP-FPLC de los sobrenadantes purificados. El análisis MALDI-TOF MS de las fracciones antimicrobianas eluidas de RP-FPLC reveló la existencia de fragmentos peptídicos de menor y mayor masa molecular de lo esperado. El análisis MALDI-TOF / TOF MS de péptidos seleccionados de muestras de FP-FPLC eluidas con actividad antimicrobiana indicó la presencia de fragmentos peptídicos no relacionados con la secuencia de aminoácidos de las bacteriocinas clonadas.We have evaluated the cloning and functional expression of previously described broad antimicrobial spectrum bacteriocins SRCAM 602, OR-7, E-760, and L-1077, by recombinant Pichia pastoris. Synthetic genes, matching the codon usage of P. pastoris, were designed from the known mature amino acid sequence of these bacteriocins and cloned into the protein expression vector pPICZαA. The recombinant derived plasmids were linearized and transformed into competent P. pastoris X-33, and the presence of integrated plasmids into the transformed cells was confirmed by PCR and sequencing of the inserts. The antimicrobial activity, expected in supernatants of the recombinant P. pastoris producers, was purified using a multistep chromatographic procedure including ammonium sulfate precipitation, desalting by gel filtration, cation exchange-, hydrophobic interaction-, and reverse phase-chromatography (RP-FPLC). However, a measurable antimicrobial activity was only detected after the hydrophobic interaction and RP-FPLC steps of the purified supernatants. MALDI-TOF MS analysis of the antimicrobial fractions eluted from RP-FPLC revealed the existence of peptide fragments of lower and higher molecular mass than expected. MALDI-TOF/TOF MS analysis of selected peptides from eluted RP-FPLC samples with antimicrobial activity indicated the presence of peptide fragments not related to the amino acid sequence of the cloned bacteriocins.